«ПЕРВЫЙ СРЕДИ РАВНЫХ...»
Нормативные документы
Противодействие коррупции
Поступающим
Студентам
Выпускникам
Проект 5-100
Аккредитация специалистов

    Выполняемые проекты/ ФЦП, СОГЛАШЕНИЕ № 14.604.21.0151

    Приоритетное научное исследование, выполняемое
    в рамках ФЦП
    «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы»


    Номер Соглашения о предоставлении субсидии: 14.604.21.0151
    Тема: «Разработка мембранного каскадного электродиализатора для сепарации стволовых клеток и факторов роста с использованием функциональных микро-и нанобиопористых мембран»
    Приоритетное направление: «Индустрия наносистем»
    Критическая технология: Технологии биоинженерии.
    Период выполнения: с 21.10.2014 по 31.12.2016 г.
    Получатель/Исполнитель: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

    Индустриальный партнер: Закрытое акционерное общество « Международный инновационный нанотехнологический центр»
    Ключевые слова: трековые мембраны, аффинные мембраны, биологические активные вещества, факторы роста, 3Д каркас, биоконструкция, стволовые клетки, нанобиоконструкции, нанотехнологии, технологии прототипирования, электродиализ, сепарация, изолирование.


    1. Цель проекта
    Использование основных принципов получения и методик контроля биосовместимых микро-и нанопористых мембран и разработка принципов каскадного электродиализа на их основе с использованием аффинных антител к специфическим маркерам для выделения полностью сохранных биологически активных веществ, факторов роста и стволовых клеток из биологических сред таких как, кровь и жировые ткани. Изолированные компоненты должны соответствовать требованиям, предъявляемым к биосовместимым материалам, используемым для изготовления создания трехмерных наноконструкций для формирования прототипов органов и тканей.

    Цели проекта.
    В ходе выполнения ПНИ должны быть получены следующие научно-технические результаты:
    1.1 Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ, содержащие:
    а) а) анализ научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов, относящихся к разрабатываемой теме;
    б) обоснование выбора направления исследований;
    в) результаты теоретических и экспериментальных исследований;
    г) обобщение и выводы по результатам ПНИ.
    1.2 Отчет о патентных исследованиях, оформленный в соответствии с ГОСТ 15.011-96.
    1.3 Лабораторный технологический регламент получения экспериментальных образцов биосовместимых микро-и нанопористых мембраны с модифицированной пространственной конфигурацией для каскадного электродиализатора сепарации и изолирования, полностью сохранных биологически активных веществ, факторов роста и стволовых клеток с размером от 15 нм до 1500 нм и факторов роста типа IL-6, LIF, SCF, VGEF, ФНО.
    (Краткое описание факторов роста изложено в Приложении 1 к Техническому заданию).
    1.4 Лабораторный технологический регламент использования каскадных нанопористых мембран с модифицированной пространственной конфигурацией в сочетании с каскадным эектордиализатором для получения сохранных биологически активных веществ, факторов роста и стволовых клеток необходимых для синтеза и пролиферации различных клеток на различных 3D матриксах и скаффолдах, биоинженерного создания новых органов и их фрагментов, а так же для последующего выделения и концентрации полученных биологически активных образцов с помощью хроматофоров.
    1.5 Программа и методика исследовательских испытаний экспериментальных образцов биосовместимых микро-и нанопористых мембран с модифицированной пространственной конфигурацией аффинных антител и направленным электродиализом для получения сохранных биологически активных веществ, факторов роста, стволовых клеток с сохранным рецептурным аппаратом, преимущественно гликанов и гликопротеидов (CD31; CD49; CD51; CD61; CD13; CD23; CD44; CD73; CD45: CD133). (Краткое описание маркерных антигенов изложено в Приложении 1 к Техническому заданию)
    1.6 Программа и методика исследовательских испытаний микро-и нанопористых мембран и направленного каскадного электродиализа для получения сохранных биологически активных веществ, факторов роста и стволовых клеток.
    1.7 Технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера - организации реального сектора экономики.
    1.7.1 Разработка конструкции и изготовление устройств каскадного электродиализа на трековых мембранах для сепарации стволовых клеток и факторов роста из малых объемов биологических материалов (от 50 до 2000 микролитров), комплементарной с уже существующими устройствами выделения стволовых клеток, работающих на принципах магнитной сепарации и цитофлоуметрии.
    1.8 Проект технического задания на проведение ОКР по теме «Разработка универсального комплекса для сепарации стволовых клеток ,биологически активных веществ и факторов роста для прототипирования органов и тканей».

    2. Основные результаты проекта
    Этап №1. с 21.10.2014 по 31.12.14
    Работы по Плану-графику:
    1.1 Аналитический обзор информационных источников.
    1.2 Проведение патентных исследований по ГОСТ Р15.011-96.
    1.3 Сравнительная оценка эффективности возможных направлений исследований в рамках разделения СК и ФР.
    1.4 Выбор и обоснование направлений исследовании, методов и средств получения каскадных микро- и нанобиопористых мембран с модифицированной пространственной конфигурацией и КЭД.
    1.5 Создание экспериментальной базы, обеспечивающей проведение исследований по проекту: закупка реактивов, комплектующих и прочих расходных материалов.

    Аналитический обзор информационных источников (n=137) свидетельствовал , что разработка соответствует мировому уровню. Для изготовления тканеинженерной конструкции будут использованы материалы и технологии, активно применяемые в ведущих мировых научно-исследовательских центрах, исследовательских группах, занимающихся тканевой инженерией (Япония, Южная Корея, США, Китай).
    1.6 Материально-техническое обеспечение проекта.
    1.7 Обеспечение участия в мероприятиях, направленных на освещение и популяризацию промежуточных результатов ПНИ.

    По п. 1.1 ПГ выполнен аналитический обзор информационных источников, проанализировано 87 источников.
    По п. 1.2 ПГ проведено патентное исследоване по ГОСТ Р15.011-96, в ходе которого отобрано 36 патентных документа.
    По п. 1.3 ПГ. выплонена сравнительная оценка эффективности возможных направлений исследований в рамках разделения СК и ФР.
    По п. 1.4 ПГ осуществлен выбор и сделано обоснование направлений исследовании, методов и средств получения каскадных микро- и нанобиопористых мембран с модифицированной пространственной конфигурацией и КЭД.
    По п. 1.5 ПГ создана экспериментальная база, обеспечивающая проведение исследований по проекту: закуплены реактивы, комплектующие и прочие расходные материалы
    По п. 1.6 ПГ осущеcтвлено материально-техническое обеспечение проекта.
    По п. 1.7 ПГ обеспечено участия в мероприятиях, направленных на освещение и популяризацию промежуточных результатов ПНИ.

    Аналитический обзор современной научной литературы показал высочайшую актуальность исследования в направлении выделения и селекциии аутологических клеток, определил существующие технические решения в выделении биологических объектов (сепарация, фильтрация и др.), а также выявил основные сущевующие типы мембран для фильтрации биообъектов и перспективы их модификации. Тажке были обозначены технологии верификации клеточного материала и его наработка для дальнейшего применения в биологии и медицине.

    Гетерогенная стромально-васкулярная фракция жировой ткани содержит популяцию стромальных клеток, характеризующихся высокими адгезивными свойствами, фенотипом, характерным для МСК, и способностью к мультилинейной дифференцировке. Относительная простота и низкая травматичность процедуры получения жировой ткани, возможность выделения из нее значительного количества стволовых/прогениторных клеток, способных к селективному размножению в недифференцированном состоянии с последующей дифференцировкой в клетки различных тканей, позволяют рассматривать СКЖT в качестве перспективного объекта для аутологических трансплантаций. Самым сложным вопросом остается получение стабильного количества СКЖТ для решения клинических задач. В настоящее время используются различные методы выделения клеточного материала или их комбинацию – гравитационная сепарация. магнитная сепарация, фильтрация и др. с последующей культивацией и криоконсервацией .

    Наибольший опыт выделения клеток имеется при работе с системой крови. Самой частой клинической технологией выделения и сохранения клеточной массы является сбор и реинфузия клеток крови при хирургических операциях. Используют центрифужный или фильтрационнный методы .Центрифужный метод разделения эритроцитов от плазмы позволяет достаточно быстро произвести сепарацию, однако известно , что превышение гравитационной нагрузки более 5600 об/мин , что соответствует нагрузке равной g, возможно разрушение клеток. Одной из причин, ограничивающих клиническое применение МСК, является необходимость размножения их в культуре. Следствием присутствия в составе сред для культивирования клеток высоких концентраций сыворотки крови животных (эмбриональной телячьей или лошадиной сыворотки) может являться риск инфицирования пациента агентами прионной природы или зоонозными инфекциями, даже, несмотря на то, что сыворотки от ведущих производителей тестируются по десяткам показателей. Другая опасность заключается в возможности иммунизации пациента ксеногенными белками, что особо опасно при повторном введении клеточного материала. И то и другое диктует необходимость поиска альтернативных путей культивирования МСК человека. Технологии культивирования удлинняют и усложняют лечебную процедуру. Целесообразен и актуален поиск методов выделения и наращивания объемов клеток on line интраоперационно с высокой степенью верификации СКЖТ и биоактивных веществ влияющих на их жизнеспособность и развитие. Мембранные технологии в настоящее время являются одними из самых востребованных. Об этом говорят и разнообразие используемых на практике мембран, и широкий спектр их использования в самых актуальных направлениях жизнедеятельности человека (энергетика, экология, медицина, химическая и нефтегазовая промышленность, опреснение и очистка воды и т.д.). Все это возрождает интерес исследователей и к изучению свойств мембран, и к разработке мембран нового поколения. Мембраны нового поколения могут быть созданы только в рамках нанотехнологий, способных повысить эффективность их работы на порядки. Переход на наноразмерный уровень требует привлечения новых идей и развития теоретической и экспериментальной баз исследований. В наноразмерных мембранах наблюдаются эффекты, еще не нашедшие своего объяснения в рамках существующих моделей. Наиболее привлекательными по возможностям точного моделирования пор являются трековые мембраны, обеспечивающие все диапазоны работы фильтра от осмоса до микро- и макрофильтрации. У трековых мембран все поры являются «калиброванными». Ни один другой материал для микрофильтрации не обладает таким свойством. По существу для трековых мембран характерен ситовый механизм задержания микрочастиц. Поэтому трековые мембраны используются в качестве эталонного теста при определении селективности других типов фильтров. Трековые мембраны характеризуются исключительно малой дисперсией пор по размерам (5 – 10 %), высокой селективностью и производительностью, имеют низкую адсорбционную способность по отношению к вирусам, клеткам, биополимерам, практически не содержат компонент, способных мигрировать в фильтрат. Размер пор можно варьировать от 0,03 до 5 мкм при плотности пор от 10 до 105 см. Процесс фильтрации протекает на поверхности ТМ и размеры пор не меняются в процессе фильтрации. Таким образом ТМ являются наиболее перспективным типом мембран для применения в каскаде выделения клеток и биоактивных веществ в связи с особенностями строения и возможностей модификации свойств по необходимому запросу. Основными этапами очистки СКЖТ является панель верификации клеток разных клонов. Наиболее точными методами, кроме магнитной сортировки, лазерной проточной цитофлоуметрии являются методы иммунофенотипирования. Обсуждается широкая панель антигенов для верификации СКЖТ - позитивны по: НЬА-АБО, CD9, CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD59, CD105, CD49e, CD54, CD55, CD166 Негативны по: HLA-DR, CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD18, CD31, CD45, CD50, CD56 . Однако в реальной работе спектр панели может быть оптимизирован до CD10 – 68,08 %, CD13 – 96,53%, CD34 – 4,38 %, CD44 – 93,08%, CD45 – 3.28%, CD90 – 98,36%, CD105 – 90,18%, CD117 – 2,30%. В ходе изучения путей оптимизации технологий выделения и наработки CК стало очеевидным необходимость комбинирования технологий в одной конструкции на основе современного материаловедения и нанотехнологий . Создание микроэлектронных систем с биосенсорами на основе наномембран является наиболее многообещающим направлением.

    В результате патентного поиска и при анализе определенных регламентом поиска рубрик МПК в базах ФИПС и стран минимума РСТ, а именно в системе поиска esp@cenet, а также на сайте www.uspto.gov, найдено более 200 документов отвечающих тематике НИР. Из них отобраны 26 документов.

    Максимальная патентная активность приходится на 2005-2010 годы. В ходе патентных исследований были получены следующие результаты:
    1) патентная активность в России выражена средне и оставляет возможности по оформлению патентов на изобретения и полезные модели для технических решений, приборов и элементов устройств, которые будут разработаны в рамках НИР; 2) исследование тенденций развития основных применяемых технологий позволило установить, что возможными путям решения проблемы сепарации стволовых клеток и факторов роста может являться технология каскадного электрофореза и диализа на трековых мембранах как идеального сита, которая в настоящее время, несмотря на свою простоту и эффективность, не используется для разделения стволовых клеток и факторов роста. Поскольку одним из основных элементов каскадного диализатора являются трековые мембраны с различными диаметрами пор от десятков микрон до десятков нанометров, необходимым является исследование особенностей и способов модицикации трековых мембран и фракционирования с их использованием. Кроме того, придание трековым мембранам аффинных свойств по отношению к выделяемым целевым компонентам с использованием методов ковалентного связывания позволит повысить селективность процесса за счет высокоселективного адсорбционного взаимодействия по принципу «антиген-антитело».

    По результатам оценки возможных направлений исследований методов выделения и разделения стволовых клеток различной степени дифференцировки и факторов роста, нами было выявлено что существующие методы чрезвычайно трудоемки и продолжительны во времени. Наиболее перспективным является разделение биологических жидкостей с помощью энзимного метода, однако для данного способа существует большое количество ограничений. В частности при использовании автоматизированных машин для энзимного разделения СК и ФР, происходит неконтролируемое получение всего спектра факторов роста без возможности выбора конструкций и клеток с заданными параметрами. Существующие на сегодняшний день фильтры обладают низкоизбирательными мембранами, так же не позволяющими получать факторов роста с заданной молекулярной массой и пространственной конфигурацией, что в свою очередь чрезвычайно важно для интеграции результатов экспериментальной работы в практическую медицину в целом и тканевую инженерию в частности. Исходя из этого, предложенное нами научно-практическое направление, является чрезвычайно перспективным для получения цельных факторов роста и стволовых клеток с конкретными заданными пераметрами.

    По результатам выбора и обоснования направлений исследовании, методов и средств получения каскадных микро- и нанобиопористых мембран с модифицированной пространственной конфигурацией и КЭД были сделаны следующие выводы. Возможными путям решения проблемы сепарации стволовых клеток и факторов роста может являться технология каскадного электрофореза и диализа на трековых мембранах как идеального сита. Метод каскадного элетродиализа достаточно хорошо зарекомендовал себя в практике препаративного выделения целевых компонентов из сложных биологических объектов как кровь. Применение его позволит при определенных режимах вести быструю и «деликатную» сепарацию по типу применяемых в микро-и нанофлюидных устройствах. Одним из основных элементов каскадного диализатора являются трековые мембран с различными диаметрами пор от десятков микрон до десятков нанометров. В итоге каскадный мембранный электородиализатор будет обладать: способность к неразрушающей – «деликатной» фильтрации/сепарации компонентов крови, жировой ткани с заданной молекулярной массой и пространственной ориентировкой, а так же сохранения поверхностных рецепторов плюрипотентных стволовых клеток различных биологических сред типа рецептеров к SCF, IL-6, LIF и STAT-3; способность быстрого (не более 1 часа) выделения индивидуальных фракций целевых компонентов из объемов не более 1500 микролитров. Созданная система сепарации позволит упростить и повысить качество получения биологически активных веществ и стволовых клеток из крови и жировых тканей, т.е приблизиться по своим технологическим и эксплуатационным параметрам к универсальной.

    В отчетный период была также создана экспериментальная база, обеспечивающая проведение исследований по проекту, для чего была осуществлена закупка реактивов, оборудования, инструментария, комплектующих, расходных материалов для забора и обработки биологически активных сред организма. За этот же период осущетвлено материально-техническое обеспечение проекта, которое заключалось в закупке оргтехники и комьютеров, канцтоваров, обеспечении доступа к сети RUNNET и интернет, приобретении морозильной камеры, покупке медицинских расходных материалов, а также оплате утилизации медицинских отходов, оплате теплоэнергии и электроэнергии.

    В порядке обеспечение участия в мероприятиях, направленных на освещение и популяризацию промежуточных результатов ПНИ, на научно-практической конференции «Реализация прикладных научных исследований и экспериментальных разработок по приоритетному направлению «Индустрия наносистем», прошедшей 24-25 ноября 2014 года на базе НИТУ «МИСиС» в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы», были доложены цели, задачи, перспективы и планируемые
    результаты ПНИ, а также были представлены предварительные результаты исследований и потенциальные возможности исполнителей. После проведенной дискуссии ПНИ была признана актуальной, перспективной и имеющей все возможности к достижению поставленных результатов.
    Полученные результаты запланированных работ на первом этапе ПНИ соотвтетствуют техническим требованиям к выполняемому проекту и подтверждают перспективность продолжения работ по проекту.

    Таким образом, согласно техническому заданию и плану-графику проведены все работы по 1 этапу.
    Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

    Этап №2, с 01.01.2015 по 30.06.2015.
    Работы по Плану-графику:
    2.1 Разработка требований к каскадным микро- и нанобиопористым мембранам с модифицированной пространственной конфигурацией.
    2.2 Разработка требований к техническому обеспечению, радиационно-химического способа получения каскадных микро- и нанобиопористых мембран.
    2.3 Проведение исследований по конструированию микро- и нанобиопористых мембран.
    2.4 Материально- техническое обеспечение выполнения работ этапа.
    2.5 Модернизация инфраструктуры по забору крови и жировых тканей и выделению СК и ФР из крови и жировых тканей;
    2.6 Облучение полимерных пленок пучками тяжелых ионов для проведения работ по конструированию микро- и нанобиопористых мембран

    На 2 этапе были разработан новый тип трековых мембран с модифицированной пространственной конфигурацией и повышенной производительности для фильтрации вязких жидкостей.
    Разработаны методики облучения высокоэнергетическими частицами; методика обработки УФ-излучением для создания асимметрии; методика химического травления для получения пор с переменным по длине сечением
    Проведена доработка и модификация технологического оборудования, необходимые для реализации созданного технического решения
    Проведены оптимизационные экспериментальные работы и разработаны условия получения экспериментальных образцов МНМ с модифицированной пространственной конфигурацией
    Выполнено сравнение между качеством биологического материала полученного в эксперименте путем вакуумной липоаспирации на малом отрицательном давлении, фрагментов жировой ткани полученной прямым эксцизионным методом и крови полученной путем пункции ушной вены.
    Выбор способа деликатной вакуумной липоаспирации на минимальном отрицательном давлении - основным методом получения относительно живых стволовых клеток. Отработана и систематизирована методика получения, хранения и последующей транспортировки биологического материала.

    Этапный Отчет направлен Заказчику.