«ПЕРВЫЙ СРЕДИ РАВНЫХ...»
Нормативные документы
Противодействие коррупции
Поступающим
Студентам
Выпускникам
Проект 5-100
Аккредитация специалистов

Как легко и просто нокаутировать весь геном

Как легко и просто нокаутировать весь геном

Новый метод модификации некодирующей ДНК значительно облегчит и удешевит процесс создания генетически модифицированных животных.

Гены составляют всего лишь около 2,5-3% ДНК человеческого генома, и причиной развития генетически обусловленных заболеваний зачастую является не поломки генов, а мутации некодирующей ДНК, составляющей бОльшую часть хромосом. Часть некодирующей ДНК регулирует генную активность и процессы упаковки ДНК в ядре. По данным разных авторов, действительно бесполезной – «мусорной» – является от 5% до 50% некодирующей ДНК, однако, вполне возможно, что и она выполняет какие-то важные функции.

Ученые университета штата Юта, работающие под руководством профессора Марио Капеччи (Mario Capecchi), занимаются разработкой методов прицельного «нокаутирования» генов и некодирующих фрагментов ДНК, позволяющих изучать функции этих генов и моделировать различные генетически обусловленные заболевания человека.

По словам Капеччи, существующая методика нокаутирования генов очень хороша, однако существенным ее недостатком является дороговизна. Создание линии мышей с нокаутированным геном стоит около 10000 долларов США. Получается, что на то, чтобы по одному нокаутировать все 20000 мышиных генов, науке придется потратить 200 миллионов долларов, а если прибавить еще около 300000 некодирующих последовательностей, изучение мышиного генома обойдется минимум в 3 миллиарда долларов.

Авторы предлагают новый метод, позволяющий значительно ускорить создание трансгенных животных и снизить затраты на создание линии мышей с одним нокаутированным геном или некодирующей последовательностью до 200 (!) долларов.

Существующая методика подразумевает проведение многочисленных манипуляций над стволовыми клетками мышиного эмбриона, что значительно понижает их жизнеспособность.

Для осуществления нового метода авторы предлагают использовать короткие фрагменты ДНК, известные под названием loxP. Эти фрагменты являются метками, указывающими белковому продукту гена Cre на место предполагаемого разреза ДНК. loxP встраивают в хромосому одной мыши и в другое место той же хромосомы другой мыши (при этом оба животных должны иметь ген Cre). Потомки, рождающиеся в результате скрещивания таких животных, имеют два фрагмента loxP в одной хромосоме, и ген Cre, который служит матрицей для синтеза белка, разрезающего хромосому между двумя метками loxP.

Мышей с поврежденной таким образом хромосомой скрещивают с нормальными животными, в результате чего с вероятностью 10% появляются особи, в геноме которых желаемая последовательность ДНК удалена или продублирована. Это позволяет оценить последствия такой мутации и выяснить роль, выполняемую изучаемым фрагментом ДНК в организме.

Наглядный пример применения нового метода приведен на рисунке: авторы нокаутировали ген, участвующий в формировании скелета, мутация которого приводит к деформации хвоста и конечностей (слева).

Метод можно также использовать для индукции хромосомных транслокаций – обмена участками между двумя хромосомами. Известно, что такие поломки лежат в основе многих злокачественных заболеваний, в том числе некоторых сарком, лейкемий и лимфом. Существующие методы позволяют получить желаемую транслокацию двух хромосом в 1 из 10 миллионов клеток, в то время как новый подход повышает эффективность в 10 000-100 000 раз.

Использование транспозона («прыгающего гена») piggyback приводит к бессистемному встраиванию последовательностей loxP в различные места мышиного генома. Скрещивание получающихся животных с мышами, имеющими ген Cre, позволяет мутировать любой участок ДНК, находящийся между фрагментами loxP.

Мышиный геном полностью секвенирован, что позволяет ученым идентифицировать меченые loxP участки ДНК и выбирать животных, подходящих для запланированных исследований.

Если loxP встраивается внутрь гена, возникает мутация, блокирующая его активность, в результате чего, без больших финансовых затрат, можно получить линию мышей с нокаутированным геном. Таким образом, новый метод должен обеспечить значительное ускорение осуществления проекта Национальных институтов здравоохранения США, целью которого является последовательное нокаутирование всего мышиного генома.

Детальное описание метода опубликовано в журнале Nature Genetics.

По материалам University of Utah.


24.06.2007

cbio


Привязка к разделам:  Новости науки

Назад